Выделение вируса на культуре клеток
Культуры клеток пригодны для выделения большинства вирусов животных. Для этой цели используют как первично-трипсинизированные, так и перевиваемые и диплоидные культуры клеток.
Заражение культур клеток проводят следующим образом. Из пробирок или матрасов выросшим монослоем клеток удаляют ростовую питательную среду, отмывают монослой клеток от ростовой среды ( в ней могут быть антитела к исследуемому вирусу и неспецифические ингибиторы) раствором Хекса и вносят вируссодержащий материал. После контакта ( 1-1,5 ч) , необходимого для адсобции вируса на клетках, вирусосодержащий материал удаляют и вносят поддерживаюую питательную среду, которая не способствует размножению клеток, не обеспечивает их жизнедеятельности. Пробирки и матрасы помещают в термостат для инкубации. Адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают в клетки, репродуцируются в них и выводят в культуральную жидкость, заражают новые клетки, затем следующие и так до тех пор, пока не останется живых клеток.
Обнаружить вирус в клетках можно следующими методами (или признаками):
1)по цитопатическому действию (ЦПД) или цитопатическому эффекту (ЦПЭ). ЦПД- это любые изменения клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Для обнаружения ЦПД зараженные культуры клеток просматривают под малым увеличением светового микроскопа. Формы ЦПД могут быть вемьма разнообраными, что зависит от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т.д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2-3 суток после заражения (энтеровирусы), другие- 1-2 нед. (аденовирусы). Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация, округление клеток, симпластообразование .
Фрагментация - разрушение клеток на отдельные фрагменты (вирус везткулярного стоматита др.)
Округление - клетки принимаю шаровидную форму и отделяются от стекла ( адено-, пикорнавирусы и др.)
Симпластобразование - образование гигантских клеток: цитоплазма соседних клеток сливается в следствие растворения клеточных оболочек и образуется одна большая клетка со многими ядрами( вирус ПГ-3, чумы крупноо рогатого скота и др.);
2) с ее помощью в культуре клеток можно обнаружить некоторые вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами: вирусы ПГ-3, гриппа и др. реакцией гемадсорбции. Гемадсорбцией называется прилипание (адсорбция ) эритроцитов крови на поверхности клеток, зараженных вирусом. Этот метод широко используется при диагностике П-3 крупного рогатого скота, при этом используют эритроциты морской свики (цв.вкл.,рис.19);
3) методом образования “бляшек”. Этот метод технически сложнее других и применяется главным образом для титрования и клонирования вирусов;
4) обнаружение вируса в РИФ. В том случае, если размножение вирусов в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить при помощи флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при дианостике классической чумы свиней, парвовирусных инфекций, бешенства и др.;
5) иммунопероксидазной реакцией;
6) путем обнаружения внутриклеточных включений. Для выявления телец-включений культуру клеток выращивают на покровных стеклах, помещенных в пробирки, заражают испытуемым материалом и через определенные сроки инкубации (при 37°С), стекла промывают, фиксируют и окрашивают различными методами (гематоксилин-эозином, акридиновым оранжевым и др.).
Размножающиеся в культурах клеток вирусы частично или полностью ( в зависимости от степени разрушения клеток) выходят в культурную жидкость, которая и используется как готовая суспензия вируса. Если не все клетки культуры разрушились в результате размножения в них вируса, то их разрушают путем 2-3- кратного замораживания и оттаивания или ультразвуком.