Навигация по сайтуНавигация по сайту

Возбудители лептоспироза

ВОЗБУДИТЕЛИ:

L.interrogans, L.borgpetersenii, L.kirschneri, L.noguchii, L.santarosai

Таксономия

Анализ рибосомальной РНК показал родство лептоспир (ЛС) с другими спирохетами, подтвердив тем самым правомерность включения на основании фенотипических свойств рода Leptospira в семейство Spirochaetales порядка Leptospiraceae, относящегося к типу Spirochaetes.

До 1987г род Leptospira объединял 3 вида ЛС:

1. L.interrogans - патогенные для млекопитающих ЛС, превращающиеся в 1М растворе хлористого натрия при 20-30°C в течение 2 ч в сферические клетки. При температуре 13°C и в присутствии 225 мкг/мл 8-азагуанина не растут.

2. L.biflexa - непатогенные и сапрофитные ЛС, которые не трансформируются в сферические клетки в 1М растворе хлористого натрия при 20-30 °C в течение 2 ч, но растут и размножаются при температуре 13°C и в присутствии 225 мкг/мл 8-азагуанина.

3. L.parva - сапрофиты, обладающие сходными с L.biflexa свойствами, за исключением отсутствия способности расти в присутствии 8-азагуанина.

Сравнение генома перечисленных видов ЛС с помощью рестрикционного эндонуклеазного анализа хромосомной ДНК (48), гибридизации ДНК с использованием повторяющихся последовательностей (81), риботипирования (84) и ПЦР (88) показало гертерогенность существовавших нозологических единиц и необходимость внесения изменений в таксономию рода Leptospira.

Прежде всего вид L.parva был перемещен в род Turneria. Таким образом, в настоящее время в роде Leptospira выделяют 12 видов (L.аlexanderi, L.biflexa, L.borgpetersenii, L.fainei, L.inadai, L.interrogans, L.kirshneri, L.meyeri, L.noguchii, L.santarosai, L.weilii, L.wolbachii и 5 геномовидов, обозначаемых цифрами 1-5). Поскольку основанием для их разделения послужили различия генома, то обычно их называют геномовидами.

На основании различий антигенного состава, выявляемого в реакциях перекрестной агглютинации-лизиса и перекрестной абсорбции антител из антисывороток патогенные виды ЛС делят на серовары, являющиеся основными внутривидовыми таксономическими единицами. Известные в настоящее время 230 сероваров патогенных ЛС разделены на 25 серогрупп (australis, autumnalis, ballum, bataviae, canicola, celledoni, cynopteri, djasiman, grippotyphosa, hebdomadis, icterohaemorrhagiaee, javanica, kirschneri, louisiana, lyme, manhao, mini, panama, pomona, pyrogenes, ranarum, sarmin, sejroe, shermani, tarassovi) (89,127).

У собак естественную инфекцию вызывают ЛС, относящиеся, по меньшей мере, к 29 сероварам 16 серогрупп 5 видов.

 

Морфология.

 

Вследствии слабого преломления света живые неокрашенные ЛС полупрозрачны. Для их обнаружения вместо световой микроскопии пользуются фазовоконтрастной и темнопольной микроскопией (ПРЛ 10:1.3). При этом агенты имеют вид серебристых спиралевидных нитей с крючковидно-загнутыми концами. Завитки спирали тесно прилегают друг к другу. Она завернута у ЛС всех сероваров вправо.

Лептоспира (микроскопирование в темном поле)

Средняя длина ЛС составляет 7-14 мкм, хотя встречаются и более короткие (3-6 мкм) и более длинные (до 30 мкм) формы. Их диаметр равен 0,07-0,14 мкм, а амплитуда завитков - 0,25 мкм. Даже при увеличении в 400-450 раз эти завитки не заметны, а клетки бактерий кажутся гладко цилиндрическими с загнутыми ввиде крючков концами (рис 23). На последних имеются пуговчатые образования, которые лучше заметны у погибших ЛС. Размер позволяет проходить ЛС через бактериальные фильтры.

Живые бактерии в жидких средах способны быстро перемещаться (прямолинейно, по кругу или вращением на месте). В полужидких субстратах их движения приобретают змеевидный характер. Периодически они становятся неподвижными, похожими на петлю веревки.

ЛС проявляют хемотаксис по отношению к веществам с повышенной вязкостью, гемоглобину и т.д. (85). Сахара оказывают противоположный эффект и даже снижают их подвижность.


Структура клетки лептоспир.

Обозначения:

1-наружная мембрана;

2-периплазматический цилиндр;

3-жгутик:

- 1-наружная мембрана (а,б,в-ее слои);

- 2-внутренняя мембрана;

- 3-периплазматическое пространство;

4-жгутики;

5-цитозоль

 

Структура клеточной стенки ЛС аналогична таковой других спирохет (рис.60). 3-5-слойная наружная мембрана окружает протоплазматический цилиндр, покрытый гибким пептидогликановым слоем, тесно ассоциирванным с внутренней цитоплазматической мембраной, как у грамположительных бактерий. В этих слоях отсутствуют гликолипиды. В пептидогликане преобладает орнитин, а не диаминопимелиновая кислота, как считалось ранее.

Наружная мембрана ЛС весьма необычна, поскольку является самой жидкой из известных на сегодняшний день. Находящиеся в ней наружные мембранные протеины при движении всегда (даже при изменении направления) смещаются в задний конец клетки. Скорость дрейфа антигенов в мембранах приблизительно составляет 11 мкм/сек (29).

Оболочка клетки окружает так называемый "протоплазматический цилиндр". Благодаря укорочению закрученных вокруг него осевых нитей последний имеет винтообразную форму.

Два жгутика (осевые нити) диаметром 20-30 нм локализуются в периплазматическом пространстве между наружной мембраной и пептидогликановым слоем оболочки. Их свободный конец уже внутриклеточного (124). Аксиальная нить состоит из сердцевины диаметром 11,3 мкм, окруженной 2 мембранными слоями толщиной 21,5 и 42 микрон (114). Она прикрепляется крючком к базальному тельцу на противоположном конце периплазматического цилиндра и идет вдоль оси клетки приблизительно до ее центра. Аксиальные нити не перекрываются между собой, как это имеет место у других спирохет (36). Структура базальных телец жгутиков такая же, как и у других грамотрицательных бактерий. Аксиальные нити обеспечивают движение и сохранение ЛС своей формы.

В культурах ЛС нередко образуют клубки, а по мере старения в них появляются дегенирирующие формы с атипичной морфологией.

Прохождение на питательных средах более 20 пассажей ведет к изменению морфологии ЛС - увеличению длины и количества завитков спирали, а также уменьшению количества электронно-прозрачных протоплазматических включений. Пассирование измененных изолятов ин виво восстанавливает их морфологию (35).

 

Антигены

Антигенный состав ЛС сложен. Наиболее важными антигенами являются протеины и липополисахарид наружной оболочки, жгутика, а также экскреторные антигены.

Трипсинизация ведет к экстрагированию из ЛС серовароспецифического антигена, состоящего из протеина (4,2 мг/мл), карбогидрата (0,39 мг/мл) и гексозамина (0,025 мг/мл). Этот антиген инактивируется при 80?С за 10 мин (87).

Обработка тиомерсалом и прогревание при 50-56 ?C не оказывают существенного влияния на антигенные свойства ЛС. При более высокой температуре (80-100?C) экстрагируются высокомолекулярные компоненты. При 121?C, а также при обработке фенолом и формалином антигенная структура бактерий разрушается (86).

При изменениии окружающих условий, в частности температуры (в процессе перехода из внешней среды в организм хозяина или при культивировании ин витро) у ЛС меняется синтез ряда протеинов цитоплазмы, периплазмы и наружной мембраны. Особенно вариабельными являются антигены наружной мембраны.

 

Наружная оболочка

В поверхностной мембране патогенных ЛС обнаружено 7 протеинов с мМас от 77 до 16 кД. Поверхностные протеины с мМас 66, 32, 45, 40 и 22 кД иммунологически идентичны у патогенных сероваров ЛС (10, 14).

Мажорный поверхностный липопротеин с мМас 32 кД термолабилен, высокоиммуногенен и видоспецифичен. Он разрушается ферментом клострипаном на 2 фрагмента с мМас 21 и 24 кД, состоящих из 5 и 19 аминокислотных остатков, соответственно (10). Протеин с мМас 66 кД занимает субповерхностное положение (14).

Липополисахарид ЛС биохимически напоминает таковой грамотрицательных бактерий, но отличается очень низким содержанием жирных кислот (менее 2%). Входящий в состав липополисахарида олигосахарид состоит из рамнозы, арабинозы, рибозы, фукозы, глюкозы, маннозы, глюкозамина, глюкуроновой кислоты и 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (116). Обработка 0,1N гидроокисью натрия ведет к отщеплению от молекулы липополисахарида карбогидратного антигена с мМас 4 кД. Оба фрагмента являются мажорными антигенами и протективными иммуногенами ЛС (115). С антигенной реактогенностью липополисахарида связаны серогруппо- и серовароспецифические свойства: у сероваров grippotyphosa и icterohaemorrhagiaee он реагирует в ЭЛИЗА только с гомологичными сыворотками, а у сероваров copenhageni, canicola и pomona дает перекрестные реакции с антисыворотками к другим сероварам (30).

Липополисахарид ЛС не пирогенен и не индуцирует у животных местную реакцию Шварцмана, но проявляет ряд других свойств липополисахаридов - токсичность, способность активировать комплемент и стимулировать митогенез лимфоцитов. Токсичность липополисахарида не высока, но ее можно выявить в культуре клеток (32).

В состав наружной мембраны ЛС в отличии от других спирохет входят 3 липопротеина. Гликолипопротеин экстрагируется из ЛС смесью хлороформа, метилового спирта и воды, взятых в соотношении 1:2:0,8. Он представляет собой гидрофильную молекулу с карбогидратной цепью, содержащей аминогруппы. Проявляет серовароспецифическую реактивность и способен индуцировать протективный иммунитет (65). Гликолипопротеин ингибирует Na+K+ATФ-азу. Такая активность связана с адсорбированными на нем олеевой и пальмитолееовой кислот (26). В состав гликолипопопротеина вирулентных изолятов входит белок с мМас 30кД, а у аттенуированных штаммов вместо него экспрессируется белок с мМас 20 кД (41). Ферменты расщепляют этот белок на фракции размером 14-66 кД. Фракция с мМас 24 кД содержит серовароспецифический эпитоп (83).

Помимо него у ЛС обнаруживают липопопротеины с мМас 41 и 36 кД. Последний не связан непосредственно с наружной мембраной, а локализуется в периплазматическом пространстве. Он интенсивно экспрессируется в основном ин витро (16), а при температуре 37?C его синтез полностью прекращается. На второй липопоротеин с мМас 41 кД температурный фактор не оказывает существенного влияния (74).

В наружной оболочке обнаружены и другие, менее изученные протеины, в частности имеющие мМас 77 и 18 кД (77).

 

Внутренняя оболочка

Пептидогликан ЛС отличается от такового других спирохет отсутствием в своем составе гликолипидов, а также преобладанием диаминопимеликовой кислоты над орнитином. Он индуцирует адгезию нейтрофилов к эндотелиальным клеткам, что является первым этапом их миграции из кровеносного русла в ткани (32).

Важнейшими компонентами внутренней оболочки ЛС являются 2 группы ферментов, проявляющих активность транспептидаз и D-аланин карбоксипептидаз. Их нуклеотидная последовательность у разных сероваров имеет незначительные различия, а степень гомологии с аналогичными белками E.coli составляет 50%. За способность связывать пенициллин их назвали "пенициллинсвязывающими протеинами" (41). Они играют важную роль в биосинтезе пептидогликана. неодинаковы. Пенициллинсвязывающие протеины ЛС имеюм мМас равную 20, 32, 41-59, 64 и 82-89 (димер) кД. У разных сероваров ЛС их набор и мМас не одинаковы (23).

 

Жгутиковые антигены

Несмотря на своеобразное положение жгутиков (в периплазматическом пространстве между наружной и внутренними мембранами), их антигены высокоиммуногенны. В сыворотке крови больных лептоспирозом людей и животных выявляют высокие титры антител к этим белкам, а антисыворотка к ним агглютинирует цельные клетки бактерий (40). Их делят на 2 класса: класс А ассоциирован с оболочкой жгутика, а класс В с его сердцевиной.

Электрофорез выявил 3 мажорных протеина жгутика, имеющих мМас 31, 35 и 33+34 (димер) кД, а также несколько минорных протеинов с мМас от 30 до 67 кД. Сравнение в иммуноблоттинге показало, что жгутиковые протеины с мМас 30-40 кД являются общими для разных сероваров, а жгутиковые антигены с мМас 20-30 кД - серовароспецифичны.

Мажорный протеин сердцевины жгутика FlaB, имеющий мМас 35 кД, состоит из 283 аминокислотных остатков. Его изоэлектрическая точка равна 9,065 (63). Флагелин FlaB у разных сероваров патогенных ЛС проявляет высокую степень гомологии в N- и C-терминальных участках, в то время, как центарльная часть его молекулы весьма вариабельна (26).

Почти такую же мМас (34 кД) имеет протеин, который образует окружающую жгутик мембрану. Аминокислотная последовательность обоих белков ЛС разных сероваров идентична (114).

 

Тинкториальные свойства

ЛС плохо окрашиваются по Граму и анилиновыми красителями. По этой причине, а также из-за морфологических изменений и утраты подвижности, происходящих во время фиксации и окрашивания мазков, окрашивание ЛС в рутинной диагностической работе проводят редко.

Тем не менее, при необходимости с этой целью пользуются методами Романовского с предварительной фиксацией осмиевой кислотой (бледно-розовое окрашивание), Киктенко (красно-фиолетовое окрашивание), Фонтана (темно-коричневое окрашивание) или импрегнации серебром по Вартин-Старри (коричнево-черный цвет) (ПРЛ 10:1.1,1.2 ; 14:1.1; 15:2.1).

Анализ тинкториальных свойств с учетом приведенных выше данных о структуре бактериальной клетки не позволяют отнести ЛС к грамположительным или грамотрицательным бактериям - их правомерно считать переходным типом бактерий.

 

Биохимические свойства

ЛС - хемоорганотрофы с дыхательным типом метаболизма. Повышенная чувствительность к солям синильной кислоты, а также результаты спектроскопических исследований свидетельствуют об участии в их дыхании цитохромной системы. Они оксидазонегативны, но каталазо- и/или пероксидазопозитивны.

Эти микроорганизмы проявляют выраженную аминопептидазную активность при отсутствии протеолитических свойств (76). По механизмам синтеза изолейцина разные ЛС различаются, что дает основание для разделения их на 3 класса (121). Микроорганизмы класса 1 осуществляют это обычным треониновым путем, представители класса 3 - уникальным (пируватным) способом, а остальные ЛС, вошедшие в класс 2, обоими способами.

ЛС способны утилизировать азот из мочевины, креатинина и саркозина, что протекает под контролем ферментов микроорганизмов - аланин дегидрогеназы, глютамат дегидрогеназы и глютамат пируват трансаминазы.

В клетках ЛС обнаружены следующие липидные компоненты: свободные жирные кислоты (41,8%), мажорный фосфолипид (14,8%), фосфатидилэтаноламин (12,9%), эфир холестерина (CE) (9,3%), липофосфатидилэтаноламин (4,9%) и дифосфатидилглицерин (1,1%). Свободные жирные кислоты представлены гексадеканоиковой (26,9%), гексадеценоиковой (15,4%), октадеценоиковой (26,5%) и октадекадиеноиковой (27,4%) кислотами. В состав мажорного фосфолипида входят тетрадекадиеноиковая (53,6%), тетрадекатриеноиковая (14,0%) и октадектадеканоиковая (13,8%) жирные кислоты. Фосфолипид с полиненасыщенными жирными кислотами и 14 атомами углерода в молекуле выявлен только у вирулентных штаммов и отсутствует у авирулентных (71).

 

Культивирование

Патогенные ЛС являются аэробными (часто микроаэрофильными) спирохетами. Ин витро при хорошей аэрации, pH 7,2-7,4 и оптимальных условиях инкубирования (температуре 28-30°C для большей части сероваров и 30-32°С для L.canicola) они культивируются намного лучше, чем другие спирохеты. Границы температуры инкубации посевов, в пределах которых возможен рост ЛС, составляют 22-37°С.

Для нормального роста они нуждаются в липидах и ненасыщенных жирных кислотах, а также витаминах В1 и В12 (33). Наличие белка в питательной среде для ЛС не обязательно. Из числа аминокислот только аспарагин оказывает на них стимулирующее действие (20). Его можно заменить полисорбатами. Обработка твина поливинилпирролидоном устраняет его токсичность для ЛС. В средах без протеина, но с обработанным этим способом твином урожай ЛС достигает 108 кл/мл (97). Неплохой альтернативой твину-80 является пируват натрия, который добавляют в среды в концентрации 100 мкг/мл (113). Наличие в субстрате сахаров угнетает их рост (7).

Наиболее интенсивно ЛС растут на жидких и полужидких питательных средах с 5-10% сыворотки крови кролика или барана (вместо сыворотки часто применяют сывороточный альбумин). Время развития одной генерации ЛС в логарифмической фазе составляет 58-68 ч, поэтому максимальный рост наблюдают на 5-10 дн.

Классической питательной средой для ЛС является среда Ногуши-Веньона. Наибольшее распространение в работе с ними получили жидкие (Уленгута, Ферворта-Вольфа в модификации Тарасова, Кортхофа и др.) и полужидкие (Флетчера и др.) агаровые среды (ПРЛ 10:2).

На жидких средах эти спирохеты растут медленно - максимальный урожай бактерий обычно получают на 5-10 дн культивирования. При микроскопировании препаратов культур в этот период в одном поле зрения (окуляр х10, объектив х40) обычно обнаруживают около 100 подвижных бактерий. Культуры ЛС в жидких средах бесцветны, не имеют запаха, при бурном росте опалесцируют. Опалесценция лучше видна в проходящем свете при легком встряхивании пробирки.

В полужидких средах на 1,5-2 см ниже поверхности появляется помутнение ввиде кольца, интенсивность которого усиливается по мере роста ЛС. В средах с 1% агара эти бактерии формируют преимущественно заглубленные колонии, контуры которых могут быть четкими или размытыми. Тенденция к заглубленному росту (феномен Дингера), обеспечивающая некоторое ограничение доступа кислорода, свидетельствует о микроаэрофильности ЛС.

В средах с 2% агара ЛС образуют поверхностные колонии, имеющие разную степень прозрачности вплоть до трудно различимых при обычном освещении. Пассирование изолятов ин виво повышает частоту образования такого типа колоний, в то время, как многократные пересевы ин витро способствуют усилению заглубленного роста (122). Чем чаще делают пересевы, тем быстрее получают пышный рост культур.

Фосфомицин (400 мкг/мл) в сочетании с 5-флуорацилом (100 мкг/мл) при добавлении в среду ингибируют размножение посторонней микрофлоры, не влияя на рост ЛС. Это позволяет использовать их в селективных средах . В качестве селективных компонентов сред применяют также мочевину, соли кобальта и антимикробные препараты (неомицин, рифампицин, фурацилин, фурагин, налидиксовую кислоту, комбинации рифампицина, полимиксина В, бацитрацина и актидиона.

В процессе хранении музейных штаммов ЛС их пересевают не реже 1 раза в месяц. Для длительного хранения культуры заливают слоем стерильного вазелинового масла или запаивают в ампулы, что предупреждает испарение среды и изменение ее рН.

Патогенные ЛС в процессе культивирования ин витро постепенно утрачивают свою вирулентность. Последнюю часто удается восстановить посредством заражения чувствительных животных, например, молодых морских свинок .

Устойчивость

Патогенные серовары ЛС чувствительны к повышенной температуре (при 45?С они погибают в воде за 45 мин, при 56°С за 30 мин и при 70?С менее, чем за 1 мин). Низкую температуру (даже замораживание), а также защелачивание среды вплоть до рН 9,8 они переносят хорошо. При рН10 бактерии необратимо утрачивают подвижность. Кислая среда для них губительна. Например, в кислой почве (рН 5,5) ЛС сохраняются до 6 нед, но при этом их титр снижается приблизительно в 2500 раз (46). В тоже время в земле с рН 6,7-7,2 и влажностью 15,2-31,4% они выживают на протяжении 2,5 мес (4).

При воздействии прямых солнечных лучей ЛС погибают за 30-120 мин. Высушивание также действует на них губительно.

На сохранение патогенных ЛС в почве и других естественных субстратах влияет не только рН, но и целый комплекс других факторов, в т.ч. влажность, интенсивность инсоляции и температура. В пресноводных водоемах срок сохранения жизнеспособности этими бактериями варьирует от нескольких часов до 1 мес, в сухой почве не превышает 2-3 ч, а в заболоченной возрастает до 7 мес (4).

На продолжительность сохранения возбудителя в воде большое влияние оказывает ее соленость. Поэтому в пресноводном водоеме, болоте или обычной луже ЛС длительнее сохраняют свою жизнеспособность, чем в лимане или море.

В жидком азоте вирулентность и жизнеспособность ЛС не меняется при наличии в криопротекторе 2,5% диметилсульфоксида. Глицерин проявляет по отношению к ним в 10 раз большую токсичность, чем диметилсульфоксид (82).

Патогенные ЛС устойчивы к 5'-фторурацилу и фосфомицину, оказывающим ингибирующее действие на сапрофитных представителей рода (79).

Ин витро ЛС проявляют высокую чувствительность к большинству используемых практическими ветеринарными врачами антибиотикам, в т.ч. к стрептомицину, левомицетину, тетрациклинам, фторхинолонам (байтрилу, флоксацину, ципрофлоксацину, тосуфлоксацину), макролидам (эритромицину и йозамицину) и лактамовым антибиотикам (17, 90, 105). МИК ампициллина для них равна 0,025-0,78 мкг/мл, пенициллина G - 0,39-3,13 мкг/мл, а бактерицидная концентрация этих антибиотиков составляет

Эти микроорганизмы довольно быстро инактивируются обычно применяемыми дезинфектантами: 0,25% раствором формалина за 5 мин, 0,5% раствором едкого натрия - за 10 мин, 1% раствором карболовой кислоты за 30 мин. ЛС погибают при давлении 2 кбар в течение 1ч (100).

Опубликовано: 24.06.2011 в 01:33

Комментарии

Комментарии отсутствуют

Выберите себе хорошего специалиста!

Понравилось? Поделитесь с друзьями или разместите у себя: