Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Часто используется в качестве экспресс-метода для индикации и идентификации вирусов.Впервые этот метод разработал К. Мюллис(США) в 1983 г. Благодаря высокой чувствительности, специфичности и простое выполнение его широко применяют в генетике, судебной медицине, диагностике и других областях.
Суть метода- амплификация, т.е. Увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК лат. В этом методе действуют матричный механизм и принцип комплементарности.Две одинарные полинуклеотидные цепи( нуклеиновой кислоты) способны связываться водородными связями в одну двуспиральную, если последовательности нуклеотидов одной точно соответствуют последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары аденин-тимин и гуанин-титозин.
ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК,начиная с двух праймперов. Праймер- это фрагмент ДНК, состоящий из 20-30 нуклеотидов. Эти праймеры(завтраки) комплементарны противоположным цепямДНК. При синтезе ДНК праймеры встраиваются в цепь новосинтезирующих молекул ДНК. Обычно ПЦР ставять в 25-40 циклов. Каждый цикл включает три этапа: первый- денатурация при 92-95 гр.С. При этом две цепи ДНК расходятся, второй отжиг, или присоединение праймеров при 50-65 гд.С; третий- элонгация, или полимеризация при 68-72 гр.С,при этом ДНК-полимеразаосуществляет комплементарное достраивание цепей ДНК-матрицы с помощью четырех видов нуклеотидов.В результате одного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. Образовавшиеся в первом цикле цепи ДНК служат матрицами для второго цикла и т .д. После первого цикла амплифицируется только фрагмент между двумя праймерами. Таким образом,идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов насинтезировать миллионы(2п) фрагментов ДНК-количество, достаточное для индикации их различными методами ( методом гибридизационных зондов,содержащих определенную мет ку, электрофорезом и т.д.). Чаще для этой цели используют метод электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.
В ПЦР из участков ДНК возбудителя используют праймеры, которые имеют уникальную последовательность нуклеотидов, характерных для определенного возбудителя.
Методика постановки ПЦР сводиться к следующему; из исследуемого материала выделяют ДНК- матрицу; в пробирке соединыют выделенную ДНК с амплификационной смесью, в которую вводят ДНК- полимераза, все 4 вида нуклеотидов, 2 вида праймеров,мгси, буфер, деионизированная вода и минеральное масло. Затем пробирки помещают в амплификатор, и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе,соответствующей виду возбудителя.Результаты регестрируют чаще методом электрофореза в 1-2%- ном аарозном геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ-лучами на трансиллюминаторе).Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня.
С целью повышения специфичности и чувствительности ПЦР применяют различные варианты: нездовую ПЦР,ПЦР с “горячим стартом” с использованием парафиновой прослойки или блокады активных центров полимеразы моноклональными антителами.Кроме того, некоторые фирмы выпускают лиофилизированные наборы реагентов для проведения амплификации ДНК, которые позволяют ускорить процесс проведения ПЦР и уменьшить возможность появления ложноположительных результатов.
В настоящее время внедряется новая технология ПЦР-ПЦР в реальном времени.Ее принципиальная особенность-мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов(цв.вкл.,рис.37). Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить пред”являемые к ПЦР требования лаборатории.ПЦР в реальном времени используют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зоны для детекции ДНК в процессе ее амплификации.ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течении 20-50 мин и теоретически способна детективировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе .Система детекции продукта в полимеразной цепной реакции “real-time” (мориторинговая ПЦР) позволяет цикл за циклом следить за накоплением амплификацированной ДНК. Система включает в себя олигонуклеотидный зонд, который способен присоединяться(гибридизироваться) к внутреннему сегменту ДНК-мишени. На 5-конце зонд помечен флуоресцентным красителем-репортером(reporter dye), на 3-конце-блакатором( quencher dye). По мере накопления продукта ПЦР зонд гибридизируется к нему, однако свечения не происходит из-за близости между репортером и блокатором.В результате копирования последовательности полимераза достигает 5- конца зонда.5”-3” экзонуклеазная активность полимеразы отсоединяет флуоресцентную метку с 5”- конца пробы, тем самым освобождая флуоресцирующий репортер от его связи с блокатором сигнала,что и приводит к увеличению флуоресценции.Уровень флуоресценции, таким образом, пропорционален количеству специфичного продукта реакции.Важно, что результаты ПЦР регистрируются по наличию флуоресценции в закрытых пробирках и, таким образом, решается еще одна из основных проблем этого метода- проблема контаминации ампликонами.
Достоинства ПЦР: быстрота анализа; высокие чувствительность и специфичность; минимальное количество исследуемого материала; простота в исполнении и возможность полной автоматизации.
Ввиду того,что чувствительностьПЦР может достиать до детекции одной копии ДНК-матрицы, существует высокая степень опасности получения ложноположительных результатов. Поэтому генно-диагностической лабораторией при постановке ПЦР необходимо неуклонно выполнять специальные требования к планировке и режиму работы.
ПЦР является одним из дополняющих методов, существующих в вирусологической дианостике . Эта реакция очень важна для диагностики вирусных инфекций, когда вирусные антигены или вирусспецифические антитела не могут быть обнаружены и когда присутствие вирусной нуклеиновой кислоты может быть единственным свидетельством заражения, особенно при латентно протекающих и смешанных инфекциях.