Навигация по сайтуНавигация по сайту

Диагностика лептоспироза

Прижизненный диагноз на лептоспироз ставят комплексно с использованием эпизоотологических и клинических исследований, обнаружения возбудителя посредством микроскопии мазков крови или мочи в темном поле, а также на основании установления высокого титра специфических антител или сероконверсии.

Обнаружение лептоспир

Постмортально обнаружить и изолировать возбудителя удается из различного секционного материала, но предпочтение отдается почкам, печени, селезенке и лимфатическим узлам.

В практику лабораторной диагностики лептоспироза в медицине и ветеринарии все шире внедряются новые методы обнаружения ЛС. К их числу относятся иммунохимические (РИФ, иммунофосфатазный и иммунопероксидазный тесты, иммунологическое окрашивание золотом) (34, 83, 102, 128), электронная микроскопия, ПЦР и ДНК-зондирование (109).

Бактериоскопия

ЛС можно обнаружить темнопольным или фазовоконтрастным микроскопированием. Основной способ исследования - метод раздавленной капли в темном поле (ПРЛ 10:1.3). В практике диагностических лабораторий окрашивания ЛС почти никогда не проводят.

Из-за низкой концентрации ЛС редко удается обнаружить микроскопией препаратов крови и, как правило, только в первые 1-3 дн болезни. Поэтому используют несколько методов концентрирования возбудителя из обработанной гепарином крови:

а) отстаивание смеси в узкой пробирке в течение 1ч с последующим микроскопированием не менее 10 раздавленных капель верхнего прозрачного слоя;

б) центрифугирование при 10000-12000 об/мин в течение 1 ч с последующим исследованием осадка.

Частота обнаружения ЛС в моче максимальна в период явного изменения ее цвета (потемнения). Микроскопируют в темном поле свеже собранную мочу или, что повышает вероятность обнаружения агента, полученный центрифугированием (10000-12000 об/мин в течение 1 ч) осадок мочи. Исследуют 10-20 препаратов раздавленной капли. Обнаружение ЛС в моче имеет наибольшее значение для выявления лептоспироносителей с хронической формой инфекции.

Легче всего обнаружить ЛС в печени и почках (поверхностном слое). Материал для исследования берут в кратчайшие сроки после гибели животного, поскольку трупное обсеменение вызывает быструю гибель этих бактерий. Для микроскопического исследования в темном поле на предметных стеклах готовят препараты раздавленной капли из взвесей тканей органа в физиологическом растворе. Для выявления ЛС в гистосрезах печени и почек применяют методы серебрения по Левадити или Вартин-Старри (ПРЛ 14:1.1). При этом ЛС окрашиваются в темно-коричневый цвет и хорошо видны на фоне золотистых тканей при просмотре в светлом поле под иммерсией.

Несмотря на то, что из-за низкой концентрации ЛС в довольно большом количестве случаев лептоспирозной инфекции собак бактериоскопия дает отрицательный результат, ценность этого метода неоспорима, т.к. он позволяет поставить диагноз в течение 1-1,5 ч.

РИФ

Использование РИФ облегчает обнаружение ЛС в патологическом материале (секционном материале, а также осадке, полученном после центрифугирования мочи, крови, других ликворах) и кормах. Широкому применению теста мешает отсутствие выпускаемых биопредприятиями диагностикумов, необходимых для его проведению.

Авидин-биотин иммунопероксидазный тест

Сочетает в себе преимущества гистологического и иммунологического исследований. Этим способом легче всего обнаружить ЛС в тонких срезах почек, хотя можно тестировать и другой патологический материал (83).

ПЦР

Характеристика этого молекулярного метода диагностики лептоспироза приведена ниже. Обычно в нем исследуют мочу и кровь собак.

Изоляция возбудителя

Получение чистых культур

Изоляция ЛС из патологического материала посевом на питательные среды является одним из наиболее чувствительных методов диагностики инфекции. Но для получения хороших результатов необходимо отсутствие антибиотиков в тестируемом патологическом материале, своевременное взятие (до начала автолиза) и правильное (при 4°C) хранение последнего. В случае исследования мочи важно также значение ее рН, как фактора, способного инактивировать бактерии. По той же причине для консервирования крови, предназначенной для проведения бактериологического анализа, применяют не ЭДТА или лимонную кислоту, а не гепарин. Пероральная дача животному гидрокарбоната натрия накануне взятия от него мочи или крови для бактериологического исследования повышает его результативность (110).

Жидкая питательная среда с 1% бычьего альбумина и 200 мкг/мл 5-флуорацила служит одной из лучших транспортных сред.

Для первичной изоляции ЛС предпочтение отдается жидким и полужидким средам. С этой целью могут быть применены селективные среды. Однако на последних может ингибироваться рост не только посторонней микрофлоры, но и ЛС (особенно в случаях низкого их титра в патологическом материале). Поэтому при первичной изоляции ЛС в селективных целях часто пользуются безсывороточными средами.

Выделение ЛС из крови инфицированных собак не всегда дает положительный результат из-за кратковременности бактериемии и развития последней в период, когда клинические признаки могут отсутствовать. Выделение гемокультуры проводят в первые 4 дн болезни, для чего 5-10 мл венозной крови засевают на 10 пробирок с питательной средой (обычно для этого используют среду Ферворта-Вольфа).

Из мочи ЛС можно изолировать на 2-3 нед болезни. Получение отрицательного результата бактериологического анализа мочи еще не говорит об отсутствии носительства ЛС, т.к. их титр может быть низким. Для повышения эффективности бактериологического анализа мочи рекомендуется предварительно дать обследуемому животному диуретик (75).

Изоляция ЛС из тканей абортированных плодов или мертворожденных щенков свидетельствует об инфицированности суки.

Оптимальная температура инкубирования посевов составляет 28-30°С, а при подозрении на инфекцию сервара canicola - 30-32°С.

Продолжительность культивирования первичных посевов достигает 12-24 нед, а субпассажей - 5-15 дн. Контроль посевов на присутствие ЛС осуществляют микроскопированием проб в темном поле, проводимом с интервалом в 1-2 нед. Продолжительность бактериологического исследования увеличивается в за счет необходимости идентификации выделенных изолятов. Цель последней состоит в дифференциации сапрофитных и патогенных ЛС, а также определении их видовой, серогрупповой и сероваровой принадлежности.

Биопроба

ЛС могут быть выделены из патологического материала посредством его инокуляции лабораторным животным: кроликам-сосунам, золотистым хомячкам, степным пеструшкам (10-30-дневного возраста) и сусликам, поскольку перечисленные животные в равной степени чувствительны к возбудителям как "желтушных", так и "безжелтушных" лептоспирозов. Другие виды лабораторных животных проявляют неодинаковую чувствительность к разным сероварам ЛС. Молодых морских свинок и белых мышей (массой 10-14 г) используют при подозрении на инфекцию серовара icterohaemorrhagiaee.

Гепаринизированную кровь, мочу, спиномозговую жидкость или суспензию гомогената внутренних органов подозреваемой в заражении ЛС собаки, а также тестируемые корма и воду вводят лабораторным животным подкожно, через скарифицированную кожу, закапыванием в глаза, внутрибрюшинно, внутривенно, интракардиально и перорально.

У молодых кроликов, золотистых хомяков и сусликов инфекция "желтушных" и "безжелтушных" ЛС вызывает развитие таких же клинических и патоморфологических изменений, как и у других видов лабораторных животных при инфекции L.icterohaemorrhagiaee. После инкубационного периода, составляющего в зависимости от патогенности штамма агента от 2 до 7 дн (реже более) температура тела поднимается до 39-41°С, животные отказываются от корма и быстро теряют в весе. У них развивается инъекция сосудов склеры глаз. На 2-5 дн клинической стадии инфекции на фоне резкого истощения температура их тела снижается ниже нормы, появляется желтушность склеры глаз, видимых слизистых оболочек и кожи. Усиленно выпадают волосы. Заболевшие животные в большинстве случаев погибают на 4-12 дн пз.

На их вскрытии обнаруживают желтушность тканей, особенно подкожной клетчатки, кровоизлияния во внутренних органах, коже, подкожной клетчатке, которые наиболее интенсивны в паховой и подмышечной областях. Типичны крупноточечные кровоизлияния в легочной ткани, которые выделяясь на общем ишемическом фоне придают легким сходство с крыльями бабочки. В печени находят красновато-желтые некротические очаги. Вследствии острого нефрита почки увеличены, надпочечники гиперемированы.

В течение инкубационного периода и всей клинической стадии инфекции ЛС циркулируют в крови животного. С появлением желтухи их обнаруживают во внутренних органах (особенно часто в печени).

В ходе биопробы по рекомендациям ВОЗ за подопытными животными ведут следующие наблюдения:

1) определяют массу тела до опыта и ежедневно в течение всего эксперимента;

2) у крупных животных (кроликов, морских свинок) дважды в сутки измеряют ректальную температуру. При ее повышении проводят микроскопию на наличие ЛС брюшного эксудата. Его собирают стерильной пастеровской пипеткой через надрез кожи, сделанный выше пупка (для избежания травмы мочевого пузыря);

3) высевают взятую из сердца кровь в пробирки с питательной средой . За выжиывшими животными ведут наблюдение в течение 1 мес, а затем подвергают эутаназии. Высевают на питательные среды гомогенат коркового слоя почек и проводят его микроскопическое исследование с целью обнаружения ЛС. Кровь из сердца исследуют на наличие специфических антител в РАЛ.

Для обнаружения патогенных ЛС в воде и иле водоемов пользуются методом Аппельмана-ван Тиля, сущность которого состоит в купании в течение 1 ч морских свинок со скарифицированной на площади в 10-20 см2 кожей брюшка. Кожу скарифицируют после удаления волос нанесением скальпелем продольных и поперечных штрихов. За животными ведут наблюдение по общим правилам. В связи с легкостью клинического течения лептоспироза у морских свинок, вызванного "безжелтушными" штаммами агента, независимо от состояния животных проводят посевы на питательные среды из крови сердца с 4-5 по 20 дн пз и микроскопирование брюшного эксудата.

В случае получения сомнительных результатов биопробы, что может иметь место при плохой сохранности поступившего для исследования патологического материала, низкой патогенности тестируемого штамма ЛС или вследствии низкой заражающей дозы, прибегают к проведению 1-2 последующих пассажей на лабораторных животных.

Идентификация вирулентных ЛС

Патогенные и сапрофитные изоляты ЛС дифференцируют по результатам биопробы, чувствительности к 8-азагуанину, бикарбонату натрия, солям меди, нитрату серебра, кобальту, сулеме и литию, гемолитической и липазной активности, солевой и температурной толерантности, суммарному содержанию гуанина и цитозина в ДНК.

Вирулентность входящих в состав сероваров штаммов ЛС варьирует в широких пределах. Поэтому чрезвычайно важным представляется поиск маркеров их вирулентности на штаммовом уровне. 1 из таких маркеров может служить белок с мМас 30кД, входящий в состав гликолипопопротеина вирулентных штаммов ЛС. У авирулентных штаммов вместо него экспрессируется белок с мМас 20 кД (40). Установлено также, что синтез трансмембранного наружного мембранного протеина у авирулентных штаммов происходит значительно интенсивнее, чем у вирулентных штаммов ЛС, а протеины с мМас 45 и 32-34 кД, наоборот, являются маркерами вирулентности этих спирохет (41).

Типирование

Патогенные штаммы ЛС относят к определенным сероварам и серогруппам по результатам их серотипирования. Дифференциацию сероваров осуществляют при помощи реакции перекрестной агглютинации-абсорбции, авидин-биотин пероксидазного теста или ПЦР.

Серотипирование

Разделение ЛС на серогруппы осуществляют по результатам перекрестной реакции агглютинации-лизиса (РАЛ). Деление серогрупп на серовары проводят в тесте адсорбционной агглютинации (РАА), с помощью антисывороток, моноклональных антител (108), рестрикционного эндонуклеазного анализа (48) и ПЦР (17, 61).

Моновалентные антисыворотки к серогруппам и сероварам получают иммунизацией кроликов культурами соответствующих штаммов ЛС (31). Детали метода иммунизации приведены в ПРЛ 10:4.1

Перекрестную РА ставят со всеми известными серогруппами и сероварами ЛС. Сравнение величины титров агглютинации-лизиса музейных и тестируемого штаммов ЛС моновалентными антисыворотками позволяет установить степень родства между ними. В случае, когда тестируемый изолят не проявляет серологического родства с музейными штаммами ЛС, его определяют как оригинальный серовар.

РАА основана на адсорбции агглютинирующих антител из моновалентных сывороток формалинизированным бактерином музейного и тестируемого штаммов ЛС. Их выращивают в жидкой среде с полисорбатом-80 и бычьим сывороточным альбумином при температуре 29°C. Антиген готовят из 4-8-дневных культур. Смесь (1:9) антисыворотки с титром не более 1:3000 и сконцентрированного центрифугированием в 60-70 раз антигена выдерживают при температуре 37°С в течение 18 ч, центрифугируют (30 мин при 10000 об/мин ) и тестируют в РАА. Снижение первоначального титра сыворотки соответствует ее истощению тестируемым штаммом. Перекрестную реакцию с истощенными сыворотками ставят по обычной схеме в ряде возрастающих разведений (1:100, 1:500 и т.д.). Оценку результатов проводят по следущим критериям:

а) при идентичности музейного и тестируемого штаммов они полностью сорбируют антитела из гомологичной и гетерологичной антисывороток;

б) сравниваемые штаммы относят к разным серотипам, если 10% или более гомологичного титра антител обнаруживается в каждой из 2 (гомологичной и гетерологичной) истощенных сывороток;

в) сравниваемые штаммы относят к разным подтипам одного серотипа, когда 1 антисыворотка после истощения гетерологичным штаммом сохраняет менее 10% гомологичного титра, а другая -10% или более гомологичного титра.

Молекулярные методы типирования

ДНК-гибридизация позволила разделить патогенных ЛС, первоначально входивших в состав вида L.interrogans sensu lato на 8 видов (127). В последующем генетические методы стали применять для типирования ЛС на подвидовом уровне. С этой целью использовали эндонуклеазный анализ генома ЛС в рестрикционном зонально-фиксированном гель электрофорезе (111), пульсовом зональном гель электрофорезе (48), ДНК-гибридизации с применением повторяющихся последовательностей нуклеотидов (81) и риботипирования (84).

Перечисленные методы не могли быть использованы для рутинной идентификации сероваров ЛС - с этой целью была применена ПЦР (88). Референтные штаммы ЛС сгруппировали на основании составления карты полиморфизма рестрикционных сайтов в ПЦР-амплифицированных генах рибосом. ПЦР в зависимости от использованного праймера (ПРЛ 10:5) позволяет выявлять в патологическом материале и идентифицировать патогенные ЛС на видовом, серогрупповом, сероварном и штаммовом уровнях (17, 61, 107). Для L.interrogans наиболее удобным маркером оказался ампликон RSPI2 праймера RSP размером около 390 пар оснований. Для идентификации L.borgpetersenii применяют зонд PR1B3, являющийся фрагментом праймера PR1 размером 680 пар оснований. Для L.kirschneri с той же целью был использован праймер KG размером 760 пар оснований (61). Перечисленные генетические маркеры отличаются высокой испецифичностью и позволяют идентифицировать практически все серовары ЛС, способные вызвать инфекцию у собак. Исключение составляют лишь серовары panama и shermani, относящиеся к L.noguchii и L.santarosai, соответственно.

С помощью ПЦР диагноз на лептоспироз может быть поставлен на основании результатов исследования всего 500 мкл крови уже через 2 дня после заражения. Ее чувствительность составляет 1-100 кл/пробу (56).

Пока еще ПЦР проводит ограниченное количество лабораторий, оснащенных специальными оборудованием и реактивами, имеющих референтные пробы ДНК возбудителей лептоспироза и соответствующие праймеры.

Серологическая диагностика

Лептоспироз может быть диагностирован также на основании обнаружения высоких титров специфических антител или сероконверсии. Кроме того, серологические тесты применяют для контроля экспериментальной инфекции лабораторных животных и типирования выделенных изолятов ЛС. Они позволяют поставить диагноз на лептоспироз в вариабельные сроки после начала болезни, определяемые динамикой антител, выявляеых используемым тестом. Специфические агглютинины и лизины обычно появляются в крови не ранее 7-8 дн после начала болезни.

Наличие противолептоспирозных антител в крови ранее прививавшихся и переболевших лептоспирозом собак не позволяет интерпретировать однократно полученные положительные результаты серологического исследования. Поэтому требуется повторное серологическое исследование больного животного через 3-5дн и более отдаленные сроки. Диагностическим считается установление 4-кратного изменения титра сывороточных антител при тестировании парных проб сыворотки крови. Необходимо иметь в виду, что у подвергавшихся антибиотикотерапии собак процесс образования антител к ЛС может быть заторможен по времени и интенсивности. Антитела к ЛС персистируют в крови собак в течение многих месяцев, а порой даже лет. У хронически инфицированных ЛС животных титры специфических антител могут снижаться ниже уровня, выявляемого рутинными методами серологической диагностики.

Для серологической диагностики лептоспироза применяют различные варианты РА (РАЛ, макроагглютинации, микроскопической аггглютинации, РЛА), РСК и ЭЛИЗА.

РА

Для постановки РА необходим набор живых культур патогенных для собак сероваров ЛС, циркулирующих на данной территории. Важнейшими факторами, определяющими специфичность РА, являются чистота и идентичность антигенов. Последнюю контролируют в лабораториях не реже 2 раз в год с применением гипериммунных кроличьих антисывороток или моноклональных антител. Чистоту антигенов ЛС регулярно проверяют посевами на кровяной агар или тиогликолевый бульон.

Музейные культуры ЛС можно хранить в жидком азоте при -70°C или в лиофилизированном виде. Частые пересевы на жидких средах нередко ведут к потере ими антигенности. В таком случае вновь возвращаются к работе с музейным штаммом.

Основными недостатками РА при лептоспирозе являются значительные затраты времени и труда на ее постановку, необходимость применения большого количества антигенов ЛС разных серогрупп, вариабельность качества используемых живых лептоспирозных антигенов, потенциальную опасность заражения проводящих серологическое исследование специалистов (при использовании в качестве антигена живых культур ЛС), субъективность оценки результатов, возможность перекрестных реакций сероваров, относящихся к разным серогруппам и недостаточно высокую чувствительность (например, при исследовании животных, выделяющих возбудителя с мочой, но не имеющих выраженного антительного ответа). Последнее связано с динамикой IgM-агглютининов (IgG в РА не выявляют).

Разработано несколько описанных ниже вариантов теста.

1. РАЛ

Со времени разработки Мартином и Петтитом в 1918г этот тест остается "золотым стандартом" серологической диагностики лептоспироза (ПРЛ 10:3.1).

Для получения антигена для РАЛ используют 7-10-дневные культуры ЛС, выращенные на жидких питательных средах и имеющие пышный рост (не менее 50 ЛС в поле зрения без спонтанной агглютинации и примесей).

Агглютинация проявляется склеиванием ЛС в агломераты, размер которых может варьировать от 3-5 бактерий до огромных шаров, занимающих несколько полей зрения микроскопа. Лизис сначала проявляется образованием зернистости у одиночных и агглютинированных ЛС. Затем бактерии постепенно теряют подвижность и фрагментируются, превращаясь в скопление аморфных зернистых образований. Агглютинация и лизис протекают в первых разведениях сыворотки одновременно, но по мере увеличения разведения сыворотки начинает преобладать агглютинация так, что в конечных разведениях лизис отсутствует (рис.61).

Специфические агглютинины появляются в крови собак через 7-10 дн после заражения. У непривитых собак в этот период титр агглютининов обычно невысок (1:100 - 1:200), но в последующем он быстро возрастает до 1:400 и выше, что считают диагностическим уровнем. Обычно к концу второй недели болезни титр антител повышается в 15-40 раз и выше. На этом уровне он сохраняется несколько недель. В последующем отмечают тенденцию постепенного его снижения. На острой стадии инфекции отмечают 4-кратное повышение титра агглютинирующих антител к ЛС при тестировании парных проб сывороток. Однако при исследовании этим тестом сыворотки хронически больных собак могут быть получены отрицательные результаты из-за низкого титра специфических агглютининов.

При оценке результатов теста необходимо принимать во внимание большую продолжительность персистенции агглютининов у многих переболевших и привитых, а также возможность отсутствия сероконверсии у части инфицированных животных (43). Стабильные титры антител 1:200 -1:400 выявленные в крови собаки с интервалом в 1-2 нед скорее свидетельствуют о ранее перенесенном заболевании или лептоспироносительстве, чем о текущей инфекции. 4-кратное повышение титра антител считатают доказательством последней.

Поскольку на динамику антительного ответа большое влияние оказывает интенсивность репродукции ЛС в организме животного, то первое серологическое исследование необходимо проводить до начала антибиотикотерапии и введения противолептоспирозных антисыворотки/Ig. В случаях неспецифической реактивности пробы сыворотки крови собак исследуют повторно после обработки 2-меркаптоэтанолом (110).

В РАЛ может быть тестирована также моча подозреваемых в заболевании лептоспирозом собак. Однако результаты такого исследования носят ориентировочный характер, поскольку титр специфических антител в моче обычно не превышает 10% титра сывороточных антител.

Реакция агглютинации-лизиса (по 1)

Обозначения:

1 - отрицательная реакция;

2-5 - положительная реакция: различная степень агглютинации и лизиса.

2. Микроскопическая реакция агглютинации (МРА)

В рутинной лабораторной практике и полевых условиях в настоящее время пользуются не РАЛ, а ее модифицированным вариантом - МРА. Тест проводят в плашках аналогично классической РАЛ, но при учете результатов оценивают лишь степень агглютинации ЛС (ПРЛ 10:3.1).

С целью снижения риска заражения лабораторных работников разработан также вариант реакции, при постановке которого вместо живых культур ЛС применяют инактивированные 0,2-0,5% формалина бактерины. При оценке результатов МРА учитывают только агглютинацию, поскольку формалинизированные ЛС не лизируются сывороткой. Из-за недостаточно высокой чувствительности эта модификация теста не нашла широкого применения.

Вместо набора антигенов разных сероваров патогенных ЛС при постановке теста может быть использован единственный антиген, которым служит штамм Patoc 1 непатогенного вида L.biflexa (118). Реакция позволяет лишь установить принадлежность тестируемого изолята к ЛС.

3. Реакция макроагглютинации (РМА)

Этот вариант РА проводят с жидкими культурами референтных сероваров ЛС, в которых рост бактерий проявляется видимой при встряхивании пробирки мутью. После добавления в них разведения (1:10) гомологичной антисыворотки в соотношении 1:5 из агглютинировавших ЛС быстро образуются хлопья, сохраняющиеся несколько суток и полностью не распадающиеся даже при энергичном встряхивании пробирок.

В модификации Смита-Тулоша (1937 г) реакцию проводят 3ч при температуре 37?С, а затем 30 мин при 55?С и учитывают результаты с помощью лупы при непрямом освещении.

Старбук и Уорд (1942 г) предложили проводить тест с формалинизированными культурами ЛС. Обработанные формалином ЛС осаждают центрифугированием и окрашивают генцианвиолетом. При постановке реакции смешивают по 1 капле антигенов и тестируемой сыворотки на стеклянной пластинке белого цвета. Ее осторожно покачивают в течение 10 мин и проводят учет результатов. Положительной реакцией считают появление в смеси рыхлых, окрашенных в синий цвет агрегатов.

4. РЛА

По чувствительности РЛА несколько уступает РАЛ, но проще в постановке и позволяет получить результат в более короткий срок. Проводится с помощью латексных частиц, на которых сорбируется антиген ЛС (90).

5. РА полимерных частиц с лептоспирозным антигеном.

Этот современный вариант РА пока еще не нашел широкого применения, хотя получил положительные отклики, как медицинских,так и ветеринарных специалистов (2, 105). В качестве носителя наружных мембранных антигенов ЛС использованы частицы поли-DL-лактид-полиэтиленгликоля, покрытые антигеном ЛС (62). Тест по специфичности соответствует, но несколько уступает по чувствительности РАЛ. Он проще в постановке и позволяет получить результат серологического исследования в течение 3 ч. Кроме того, агглютинины выявляются им в более ранние сроки и в более высоком титре, чем в РА .

Опубликовано: 24.06.2011 в 21:07

Комментарии

Комментарии отсутствуют

Выберите себе хорошего специалиста!

Понравилось? Поделитесь с друзьями или разместите у себя: